Sau rất nhiều giai đoạn chuẩn bị phức tạp thì sự kiện quan trọng cho những người có ý định sinh con bằng phương pháp thụ tinh nhân tạo cũng đã đến. Thường thì người nam đã lấy mẫu tinh trùng trước đó và mẫu này được trữ đông lại. Nếu không được chọn lại mẫu đó, thì cần phải lấy ngay mẫu tươi ngay trước khi quá trình thụ tinh bắt đầu. Có thể hiểu nguyên do vì người nam đã quá áp lực để có thể lấy mẫu như đúng yêu cầu. Đây cũng là lý do tại sao trong thực tế hay sử dụng đến tinh trùng đông lạnh. Ở các đơn vị thụ tinh lâm sàng, khi lấy mẫu trứng thì hai vợ chồng thường được ở cùng nhau.
Tinh dịch cần được chuẩn bị và rửa sạch để loại trừ những chất không tinh khiết có thể làm ảnh hưởng quá trình thụ tinh. Tinh trùng được trữ tạm thời trong môi trường nuôi cấy cho đến khi được chọn. Sau đó chúng sẽ được đặt cẩn thận trong lồng ấp đặt biệt để thực hiện điều kì diệu khi gặp trứng.
Khoảng 18-24 giờ sau khi trứng và tinh trùng kết hợp, người ta sẽ kiểm tra quá trình thụ tinh đã xảy ra chưa. Chuyên gia phôi thai học sẽ quan sát xem có 2 vùng rõ ràng trong trứng không. Một phần sẽ là nhân từ trứng mẹ, một phần là nhân từ tinh trùng của ba. Đây là sự phát triển tiền nhân khi có sự kết hợp di truyền từ ba mẹ.
Thời gian quy ước là trong khoảng 2 ngày kể từ khi thụ tinh, sau đó phôi sẽ được chuyển vào tử cung của mẹ hoặc vào vòi trứng. Vấn đề tiếp theo là chờ các xét nghiệm xác định phôi đã làm tổ hay chưa. Việc này có thể kéo dài tận 2 tuần làm cho cả hai vợ chồng lo lắng và mong chờ kết quả dương tính.
Đây là thủ thuật cao cấp và được thực hiện trong trường hợp vô sinh do nam có số lượng hoặc chất lượng tinh trùng kém. Một tinh trùng đơn độc sẽ được bơm trực tiếp vào trứng bằng một ống bơm thuỷ tinh nhỏ. Với sự hỗ trợ của kính hiển vi, các nhà khoa học sẽ đưa thẳng tinh trùng vào trong bào tương của trứng.
Đây là công việc đòi hỏi sự tỉ mỉ nên bàn, kính hiển vi và các dụng cụ phải đảm bảo bất động để tránh làm ảnh hưởng quá trình. Quan trọng hơn nữa là nhân của trứng và tinh trùng phải được bảo đảm an toàn và chỉ có 1 tinh trùng lý tưởng nhất được bơm vào. Nếu thành công, tế bào sẽ bắt đầu quá trình phân chia sau 24 giờ.
Phôi sẽ được trữ đông lạnh nếu có nhiều phôi phòng hờ dùng cho sau này. Chuyển phôi đông lạnh đã được rã đông cũng là quá trình phức tạp và sẽ rất khó khăn khi không phải phôi nào cũng sống sót trong giai đoạn rã đông. Chỉ những phôi tốt nhất với khả năng thụ thai cao nhất mới được chuyển phôi. Các khoa thụ tinh lâm sàng thường cũng tính phí riêng cho việc trữ phôi.
Việc rã đông phôi và chuyển phôi phụ thuộc một số yếu tố: như tuổi của người mẹ khi lấy trứng hoặc chất lượng và giai đoạn phát triển của trứng khi bắt đầu đông lạnh. Một số phôi đông lạnh cũng giữ vai trò quan trọng trong quá trình rã đông và chuyển phôi thành công.
Không phải vợ chồng nào cũng dùng hết phôi đông lạnh. Họ có thể quyết định làm gì với chúng: huỷ hoặc dùng cho nghiên cứu. Ngoài ra, họ có thể hiến phôi cho những cặp vô sinh khác.
Các khoa thụ tinh lâm sàng có hoạt động riêng nhưng thường cũng có việc các cặp vợ chồng tự thu xếp. Cả hai bên đều tình nguyện tham gia hiến và nhận phôi. Quá trình này được thực hiện bảo mật, chỉ có 2 bên đồng ý liên lạc với nhau. Những xem xét về các yếu tố tiền sử bệnh, tóc, màu mắt và các yếu tố di truyền đều có ích để giúp các cặp vợ chồng quyết định cho hay nhận phôi.
Đa số các khoa thụ tinh lâm sàng lập danh sách chờ cho các cặp muốn nhận phôi. Đây là nhu cầu thực tiễn cho những người đơn thân hoặc đồng tính mong muốn có con. Cũng là giải pháp cho những cặp vô sinh không dùng được chính trứng và tinh trùng của mình.
Ở mỗi giai đoạn của quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, khoa thụ tinh phải cực kì cẩn trọng để kết hợp đúng trứng và tinh trùng. Hệ thống kiểm tra, kiểm tra đối chiếu, kiểm tra và kiểm tra lần nữa là những bước thường quy. Các cặp vợ chồng thường phải ghi tên rõ ràng lên các ống nghiệm và dụng cụ thực hiện. Quá trình này là cần thiết để đảm bảo không có sai sót dẫn đến thai kết hợp di truyền không đúng cặp.
Tỷ lệ thụ thai khác nhau tuỳ vào khoa thụ tinh nhân tạo. Các khoa này thường công bố tỷ lệ thành công trên website của họ và trong các tài liệu họ cung cấp cho người dùng.